Spektrofotometr wygląda z zewnątrz jak zwykła skrzynka z klapką i wyświetlaczem. W środku kryje jednak precyzyjny układ optyczny, od którego zależy dokładność każdego pomiaru absorbancji. W tym wpisie rozkładamy aparat na części: pokazujemy z czego składa się spektrofotometr, jaką rolę pełni każdy element i na co zwrócić uwagę przy wyborze oraz eksploatacji urządzenia. Jeśli interesuje Cię przede wszystkim teoria pomiaru – transmitancja, absorbancja i prawo Lamberta-Beera – zajrzyj do naszego przewodnika Jak działa spektrofotometr.

Budowa spektrofotometru – schemat w skrócie

Niezależnie od producenta i klasy aparatu, droga światła w klasycznym spektrofotometrze UV-VIS wygląda tak samo:

źródło światła → monochromator → komora próbki (kuweta) → detektor → elektronika i oprogramowanie

Lampa emituje światło o szerokim widmie, monochromator wybiera z niego jedną długość fali, wiązka przechodzi przez próbkę w kuwecie, a detektor mierzy, ile światła dotarło na drugą stronę. Elektronika porównuje ten sygnał z pomiarem ślepej próby i przelicza go na transmitancję lub absorbancję. Poniżej omawiamy każdy z tych elementów.

1. Źródło światła – lampy spektrofotometru

To lampa decyduje, w jakim zakresie długości fali może pracować aparat:

• Lampa deuterowa (D2) – źródło promieniowania nadfioletowego, w przybliżeniu od 190 do ok. 380 nm. Jest niezbędna do pomiarów w UV, np. kwasów nukleinowych przy 260 nm czy białek przy 280 nm.
• Lampa halogenowo-wolframowa – pokrywa zakres widzialny i bliską podczerwień, od ok. 320–340 nm do ok. 1000–1100 nm.

Spektrofotometr VIS ma tylko lampę wolframową, dlatego mierzy w zakresie widzialnym – tak jest zbudowany np. spektrofotometr VIS V5000. Aparat UV-VIS ma obie lampy i sam przełącza je przy ustalonej długości fali, zwykle w okolicy 320–370 nm – przykładem jest spektrofotometr UV-VIS UV5100. W niektórych konstrukcjach stosuje się też błyskową lampę ksenonową, która obejmuje oba zakresy jednocześnie.

Lampy są elementem eksploatacyjnym – ich żywotność liczy się zwykle w setkach lub tysiącach godzin pracy. Spadek energii lampy objawia się szumem, niestabilnym zerem i błędem przy samokalibracji. Więcej o objawach zużycia i doborze zamienników przeczytasz we wpisie Lampy deuterowe i wolframowe – kiedy je wymienić, a pasujące lampy znajdziesz w kategoriach lampy deuterowe i lampy wolframowe.

2. Monochromator – serce układu optycznego

Monochromator wybiera z widma lampy wąskie pasmo o zadanej długości fali. Składa się z trzech podstawowych części:

• szczeliny wejściowej, która formuje wąską wiązkę światła,
• elementu rozszczepiającego – w nowoczesnych aparatach jest to siatka dyfrakcyjna, w starszych konstrukcjach pryzmat,
• szczeliny wyjściowej, przez którą przechodzi tylko wybrany fragment widma.

Obracając siatkę, aparat „przestraja się” na kolejne długości fali – tak powstaje skan widma. O jakości monochromatora świadczą przede wszystkim szerokość pasma spektralnego (im węższe, tym lepsza rozdzielczość pików, typowo 1–5 nm w aparatach laboratoryjnych) oraz poziom światła rozproszonego (stray light), który ogranicza dokładność pomiarów przy wysokich absorbancjach.

3. Komora próbki i kuweta

W komorze znajduje się uchwyt na kuwetę – najczęściej standardową, o drodze optycznej 10 mm. Kuweta jest pełnoprawną częścią układu optycznego, a jej materiał musi pasować do zakresu pomiaru:

• polistyren i szkło optyczne – do pomiarów w zakresie widzialnym, od ok. 340 nm,
• kwarc – do pomiarów w UV, od ok. 190 nm.

Pomiar w UV w kuwecie szklanej lub plastikowej daje zawyżone, bezużyteczne wyniki – szkło po prostu pochłania to promieniowanie. Ważne są też czystość ścianek optycznych, prawidłowe ustawienie kuwety w uchwycie i brak pęcherzyków powietrza. Szczegóły doboru opisaliśmy we wpisie Wybór odpowiedniej kuwety spektrofotometrycznej, a pełną ofertę znajdziesz w kategorii kuwety spektrofotometryczne.

4. Detektor

Detektor zamienia strumień fotonów, który przeszedł przez próbkę, na sygnał elektryczny. W spektrofotometrach stosuje się głównie:

• fotodiody krzemowe – trwałe, stabilne i wystarczająco czułe do rutynowych pomiarów; to najczęstsze rozwiązanie w aparatach laboratoryjnych,
• fotopowielacze – bardzo czułe, stosowane w aparatach wyższej klasy i tam, gdzie mierzy się bardzo słabe sygnały,
• matryce diodowe (DAD) i CCD – rejestrują całe widmo jednocześnie; w takich aparatach światło najpierw przechodzi przez próbkę, a dopiero potem jest rozszczepiane.

5. Układ jedno- i dwuwiązkowy

Ważną cechą budowy jest sposób prowadzenia wiązki światła:

• Spektrofotometr jednowiązkowy mierzy ślepą próbę i próbkę kolejno w tej samej wiązce. Jest prostszy i tańszy, ale wrażliwy na dryft lampy – przy dłuższych seriach warto co jakiś czas ponownie wyzerować aparat.
• Spektrofotometr dwuwiązkowy dzieli światło na wiązkę pomiarową i referencyjną. Aparat na bieżąco kompensuje wahania lampy i elektroniki, co poprawia stabilność długich pomiarów, skanów i kinetyki. Przykładem jest dwuwiązkowy spektrofotometr UV-VIS A560; więcej o tej konstrukcji przeczytasz we wpisie Dwuwiązkowe spektrofotometry UV-VIS.

6. Elektronika, wyświetlacz i oprogramowanie

Ostatnie ogniwo to elektronika, która wzmacnia sygnał z detektora i przelicza go na wynik. Współczesne spektrofotometry oferują zwykle kilka trybów pracy: pomiar fotometryczny przy jednej długości fali, analizę ilościową z krzywą wzorcową, skanowanie widma i pomiary kinetyczne. Wyniki można odczytać na wyświetlaczu albo przenieść do komputera – np. za pomocą oprogramowania MetaSpec Pro, które ułatwia raportowanie i archiwizację danych.

Budowa a wybór spektrofotometru – na co zwrócić uwagę?

• Zakres pomiarowy – jeśli mierzysz w UV (DNA, białka, wiele związków organicznych), potrzebujesz aparatu UV-VIS z lampą deuterową i kuwet kwarcowych. Do oznaczeń barwnych wystarczy aparat VIS.
• Szerokość pasma spektralnego – węższe pasmo to lepsza rozdzielczość, ważna przy analizie widm.
• Układ optyczny – przy długich seriach i pomiarach kinetycznych warto rozważyć aparat dwuwiązkowy.
• Dostępność części eksploatacyjnych – lamp i kuwet, a także serwisu.
• Oprogramowanie i łączność z komputerem – istotne, gdy wyniki trzeba dokumentować.

Spektrofotometry VIS i UV-VIS do pracowni, laboratoriów badawczych i kontroli jakości znajdziesz w kategorii spektrofotometry. Jeśli nie wiesz, który model wybrać, napisz do nas – pomożemy dobrać aparat do Twoich oznaczeń.