JAK DZIAŁA SPEKTROFOTOMETR — PEŁNY PRZEWODNIK
Spektrofotometr to jeden z najczęściej używanych przyrządów w laboratorium chemicznym, biologicznym i kontroli jakości. Mimo powszechności jego zasada działania bywa traktowana po macoszemu — obsługę da się opanować mechanicznie, bez rozumienia, co dzieje się wewnątrz aparatu. W tym materiale przechodzimy przez całą zasadę działania krok po kroku, od wiązki światła po wynik pomiaru.
Co spektrofotometr naprawdę mierzy
Wbrew pozorom aparat nie mierzy stężenia. Mierzy, ile światła przeszło przez próbkę — czyli transmitancję, stosunek natężenia światła za próbką do natężenia zmierzonego dla odnośnika.
Punkt odniesienia wyznacza ślepa próba — ten sam roztwór, który wstawia się przy zerowaniu, zawierający wszystko oprócz oznaczanej substancji: rozpuszczalnik, bufor, odczynniki barwiące. Zerowanie na tej próbie eliminuje wpływ kuwety, rozpuszczalnika i strat w układzie optycznym z ostatecznego wyniku.
Na wyświetlaczu widzimy jednak absorbancję, nie transmitancję. Powód jest praktyczny: transmitancja maleje ze stężeniem wykładniczo, a absorbancja rośnie liniowo, co znacznie ułatwia sporządzanie krzywych wzorcowych.
Droga światła przez aparat
Zanim światło dotrze do detektora, przechodzi przez cztery elementy:
Źródło światła. Lampa deuterowa pokrywa zakres nadfioletowy, mniej więcej od 190 do 380 nanometrów. Lampa halogenowo-wolframowa obejmuje zakres widzialny i bliską podczerwień, od około 360 do 1100 nanometrów. Aparaty pracujące w obu zakresach przełączają się między lampami w okolicach 350 nanometrów.
Monochromator. Wybiera jedną długość fali z całego widma emitowanego przez lampę. Standardem jest układ Czerny-Turnera: światło ze szczeliny wejściowej pada na zwierciadło kolimujące, które prostuje rozbieżną wiązkę, następnie trafia na siatkę dyfrakcyjną rozszczepiającą je na widmo. Drugie zwierciadło ogniskuje rozszczepione światło w płaszczyźnie szczeliny wyjściowej, która przepuszcza dalej tylko wąski wycinek. Zmiana mierzonej długości fali sprowadza się do obrotu siatki.
Komora próbki. Tutaj wiązka przechodzi przez kuwetę z badanym roztworem.
Detektor. Zamienia strumień fotonów na sygnał elektryczny. W aparatach rutynowych stosuje się fotodiodę krzemową — prostą, stabilną i tanią. Tam, gdzie natężenia są bardzo małe, stosuje się fotopowielacz z własnym wzmocnieniem wewnętrznym.
Dlaczego wybór lampy i kuwety ogranicza zakres pomiaru
Zakres pracy aparatu wynika bezpośrednio z zastosowanych lamp. Z samą lampą halogenowo-wolframową zakres zaczyna się w okolicach 325 nanometrów — wystarcza to do większości oznaczeń kolorymetrycznych. Z dodaną lampą deuterową zakres schodzi do 190 nanometrów, co otwiera oznaczenia kwasów nukleinowych przy 260 nanometrach i białek przy 280 nanometrach.
Materiał kuwety ma dokładnie takie samo znaczenie. Kuweta szklana przepuszcza światło dopiero od około 320 nanometrów, więc nawet aparat wyposażony w lampę deuterową nie zmierzy nią próbki w nadfiolecie. Do tego potrzebna jest kuweta kwarcowa, przepuszczająca od 200 nanometrów, a w wybranych gatunkach nawet od 170.
Droga optyczna, czyli szerokość kuwety, odpowiada symbolowi „l" w prawie Lamberta-Beera. Podwojenie drogi optycznej podwaja absorbancję — kuweta 50-milimetrowa da pięciokrotnie większy sygnał niż standardowa 10-milimetrowa, co bywa ratunkiem przy próbkach mocno rozcieńczonych. Kuweta o drodze 1 milimetra działa odwrotnie, pozwalając zmierzyć próbkę stężoną bez rozcieńczania.
Warto też pamiętać o dwóch rodzajach ścianek kuwety: optyczne przepuszczają światło i to przez nie musi przechodzić wiązka, matowe służą wyłącznie do trzymania kuwety w dłoni. Odcisk palca na ściance optycznej rozprasza światło i zawyża wynik pomiaru.
Prawo Lamberta-Beera
Zależność między absorbancją a stężeniem opisuje wzór A = ε · c · l, gdzie A to absorbancja, ε to molowy współczynnik absorpcji, c to stężenie, a l to droga optyczna. Współczynnik ε nie jest stałą uniwersalną substancji — jest stały wyłącznie przy określonej długości fali i w danym rozpuszczalniku, dlatego pomiaru dokonuje się w maksimum absorpcji, gdzie czułość jest największa.
Krzywa wzorcowa
Do przełożenia absorbancji na stężenie służy krzywa wzorcowa. Przygotowuje się serię roztworów o znanych stężeniach, mierzy absorbancję każdego z nich i nanosi punkty na wykres, przez które prowadzi się prostą. Standardem jest minimum pięć punktów pomiarowych i współczynnik dopasowania na poziomie co najmniej 0,99.
Dlaczego pomiar czasem odbiega od prostej
Odstępstwa od liniowości mają trzy główne przyczyny.
Pierwsza jest chemiczna: prawo Lamberta-Beera jest prawem granicznym, obowiązującym dla roztworów rozcieńczonych. W roztworze stężonym cząsteczki zaczynają na siebie oddziaływać, przez co współczynnik ε przestaje być stały.
Druga tkwi w samym aparacie: część światła omija tor optyczny jako światło rozproszone. Przy wysokiej absorbancji ten pasożytniczy sygnał zaczyna dominować i wyznacza górny pułap pomiaru.
Trzecia dotyczy szerokości pasma spektralnego. Jeśli pasmo przepuszczane przez monochromator jest szerokie w porównaniu z pikiem absorpcji próbki, aparat uśrednia sygnał z różnych długości fali, a zależność przestaje być liniowa.
W praktyce oznacza to, że najbardziej wiarygodne pomiary uzyskuje się w zakresie absorbancji od 0,1 do 1. Powyżej tej wartości warto rozcieńczyć próbkę i powtórzyć pomiar.
Zobacz też:
Spektrofotometry UV-VIS i VIS w naszej ofercie
Kuwety kwarcowe i szklane
Lampy deuterowe i wolframowe
